如何选择合适的液相色谱柱

来源：科捷仪器发布时间：2023-05-05 09:27 人气：293

怎样挑选色谱柱

现代液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的挑选。可是色谱填料的挑选规模很宽，要做适宜的挑选，有必要对此有一定的认识和了解。

1、正相色谱

正相色谱用的固定相一般为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。因为硅胶外表的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因而，分离的次序是依据样品中的各组份的极性巨细，即极性强弱的组份被冲刷谱柱。正相色谱运用的活动相极性相比照固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。

2、反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础，外表键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所运用的活动相极性较强，一般为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流谱柱的次序是极性较强组合被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保存。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

二、聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可运用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常。现在的聚合物填料的缺陷是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三、其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也现已商品化。因为其特别的性质，一般于特别的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的外表即是保存的基础，不再需其它的外表改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保存才能更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又因为HPLC活动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下运用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成安稳的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的活动相中运用。但因为氧化铝与碱性化合物作用也很强，运用规模遭到一定的限制，所以未能广泛运用，新式氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，运用PH规模1～14，温度可达100℃。因为氧化锆填料几年才开始研讨，加之面临的试验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

怎样挑选填料粒度

现在，商品化的色谱料粒度从1um到超越30um均有出售，而现在剖析分离主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料运用，在相同挑选性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是的要素。假如固定相挑选是正确，可是分离度不够，那么挑选更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；但是，3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以挑选更短的色谱柱，以缩短剖析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做活动相或添加色谱柱的运用温度，比如用乙腈替代甲醇，以下降色谱柱的压力。

一、怎么杰出的柱性能与柱寿数

◆ 认证阅读色谱柱运用说明书；

◆ 运用填充杰出的色谱柱；

◆ 尽量削减压力波动，防止机械及热冲击；

◆ 运用维护柱及在线过滤器；

◆ 经常以强溶剂冲刷色谱柱；

◆ 充分过滤样品及活动相，尽量防止杂质微粒与强保存成分；

◆ 用安稳的固定相（C18*安稳）；

◆ 在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；

◆ 色谱柱运用温度小于40℃；

◆ 硅胶基质的的色谱柱，应保持活动相的PH值规模在3.0~8.0；

◆ 在水活动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；

◆ 活动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；

◆ 过夜或贮存时，冲刷掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂活动相保存（乙晴）。

HPLC固定相及应用范围

名称别名功能基团正相反相离子对应用

Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。

SAS C1 -(CH₃)₃ √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留*

弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.

Butyl C4 -C₄H₉ √ √ 分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短。

MOS C8， -C₈H₁₇ √ √ 中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，

Octyl 极性药族化合物和环境样品。

ODS C18 -C₁₈H₃₇ √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留*强。广

泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.

CPS CN ,Cyano -(CH₂)₃CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相

(propyl 分离，当用于反相系统时，其选择性与 C8和

Nitrile) C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应

用广泛。

APS NH₂ -(CH₂)₃NH₂ √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交

(Amino Propyl) 换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性

剂做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂

不同,分析芳香族效果很好。

Phenyl -(CH₃)C₆H₅ √ √ 芳香族化合物

Diol -(CH₂)₂O √ √ 反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择

CH₂(CH₂OH)₂ 性相似,但极性较弱。

SCX 强阳离子 -(CH₂)₂C₆H₄SO₃H^-√ 有机碱

交换

SAX 强阴离子 -(CH₂)₃N⁺(CH₃)₃有机酸，核苷和核苷酸

交换

二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

1.保留值与分离度重现性不好原因分析

问题原因表现

不同色谱柱间差异填料、键合相不同保留因子（k），分离因子（α）

使用期间柱变化柱床破坏柱效（N）

键合相丢失保留因子（k），分离子（α）

硅胶基质溶解柱效（N）

强保留分堆积堵塞保留因子（k），柱效（N）

柱外效应系统差异，进样量大、柱效（N）

进样阀与色谱柱之间、

色谱柱与检测器之间管

路太长、检测器流通池

体积大、接头死体积大

等。

分离效果变差流动相组分改变保留因子（k），柱效变化很小

流速改变保留因子（k），分离因子（α）

温度改变保留因子（k），柱效变化很小

柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子（k），柱效变化很小

柱超载样品量太大保留因子（k），柱效（N）

2.造成色谱峰（不对称）拖尾的原因

1.色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷；

2.柱头有污染；

3样品超载；

4样品溶剂不合适；

5.柱外效应；

6化学或二次保留（硅羟基）效应；

7缓冲容量不足或不合适；

8重金属污染。

3.如何解决峰形拖尾的问题

A．与化学有关的拖尾问题

1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；

2．如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3．降低进样量至<1ug。

B．与色谱柱有关的拖尾问题

1．如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。

2．使用保护柱

C．与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽

1．进样体积过大，（通常≤25uL）；

2．进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（连接管应<20cm，内径为0.007″）；

3．检测器流通池的体积过大。

4．如何储存色谱柱

1．防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。

2．尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂（乙晴）中，避免在缓冲溶液中保存。

3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。

4．避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。

5．将色谱柱的两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。

如何选择保护柱

怎样选择保护柱，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料就越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。

一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。

另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手上紧即可。

另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料相匹配。对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能的选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。

仪器的主要功能和应用:

LC600A 高效液相色谱仪

LC600A 高效智能全控液相色谱仪由 P600 高压恒流泵与 UV600 紫外检测器直接构成等度 / 梯度分析系统。使用 WS600 工作站可以同时控制数台 P600 高压恒流泵、UV600 紫外检测器及恒温柱箱等，实行多元高压洗脱、波长扫描等功能。

特点：

✦LC-P600高压恒流泵

（1）往复式并联泵设计，流量精度高，压力脉动小，延长密封圈和活塞杆的使用寿命；

（2）隔膜式秒冲阻尼器与电子脉动抑制技术同时控制压力脉动保障最低的基线噪音；

（3）整体性单向阀，结构简单，密封性好；

（4）柱塞杆自动缩进，方便更换密封圈；

（5）可选配注后清洗功能，适用于使用含缓冲盐的分析条件。

✦UV600紫外检测器

（1）平行双锥孔设计的流动池，大幅提高信噪比，检测效果更佳；

（2）开机自检功能，通过图谱上486.6nm和656nm这二点的位置，以判断波长示值误差的准确性，保证极优的波长精度，保障仪器最佳状态；

（3）控制电路采用多微处理器结构，分别管理信号采集、数据处理、系统控制和通信。在做等度分析时，可以方便的通过全汉字的液晶屏与七个功能键，设置波长、滤波常数、输出量程、运行时间等参数。并且可以实现开关氘灯，光谱扫描，启动分析程序等功能；

（4）全数字交换系统，避免了色谱信号需要多重模-数转换带来的信号畸变与干扰。

✦WS600色谱工作站

（1）具有液相色谱系统控制和色谱数据处理双重功能；

（2）六种定量计算方法；

（3）多重不同浓度的标准试样校准运行，建立样品浓度-面积校正曲线；

（4）灵活的峰识别和处理能力；

（5）色谱图形、定量计算方式、峰处理参数及峰鉴定表等可保存到用户自命名的文件中。

✦具有自动在线检测功能

液相色谱原理:储液器中的流动相由高压泵泵入系统，样品溶液通过注射器进入流动相，流动相装柱(固定相)。由于样品溶液中的组分在两相中的分配系数不同，当它们相对运动时，会经历重复的时间。在吸附-解吸分配过程中，各组分的移动速度差异很大。它被分离成单一组分，依次流出色谱柱。当通过检测器时，样品浓度被转换成电信号并传输到记录仪。这些数据可以用图表的形式打印出来，供研究人员分析。